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【人类临床学】纳米孔测序同时进行药物基因的单倍型分型和重复基因检测
Original: 中国市场部 OxfordNanopore
2019-28-24
CYP2D6是药物遗传学中最重要和最广泛研究的基因之一，但它具有高度多态性，可受不同形式的结构变异的影响，并且附近有一个序列高度相似的假基因。因此使用短测序读数很难实现对其进行准确的基因分型和结构分辨。Liau及其同事在GridION平台上对CYP2D6进行了长读取扩增序列分析，从而实现了高通量基因分型，准确的单倍型分析和变异检测。该文章发表在今年6月的BioRXiv，文章的一作Yusmiati在London Calling大会上分享了研究成果。
演讲背景： CYP2D6 是一种重要的药物基因，它编码的一种肝酶负责25%药物的代谢和生物活化，其中包括可待因和抗癌药物他莫昔芬等。理解个体之间的基因差异对于研究为什么药物对一些人产生不良反应，却对一些人无效非常重要。 CYP2D6基因长4.4kb，尽管很小，但具有高度的多态性，并且与假基因CYP2D7具有 >90%的相似度。此外，CYP2D6基因还有可能会被删除或复制，发生CYP2D7的转化，两个基因杂交或串联重排，这些因素使得CYP2D6的基因分型分析非常具有挑战性。 Yusmiati Liau来自于新西兰奥塔哥大学，目前主要研究纳米孔测序和传统测序方法在药物遗传学和药物不良反应中的应用。她指出，目前CYP2D6的基因分型主要依赖于传统短读长测序或qPCR的方法，短读长测序固有的短读长序列可能会导致错误的比对到假基因CYP2D7上。而qPCR只能检测预先经过比对的变体，还有可能导致错误的基因及表型分型。Yusmiati表示，CYP2D6的准确基因分型受到该基因的多态性、与其假基因CYP2D7的高度同源性以及结构变异的发生的阻碍。长读长提供了克服其中的一些挑战的希望，并且具有直接进行变体定相的优势。他们已经建立了使用GridION纳米孔测序仪测序和分析含有整个CYP2D6基因的DNA扩增子的方法。
方法和结果: 采用纳米孔技术测序CYP2D6基因，Yusmiati设定了三个目标：1. 精确检测到所有突变体; 2. 确定单倍型; 3. 检测重复的等位基因。 Yusmiati首先通过长片段PCR来富集CYP2D6基因，在扩增文库加上条形码（barcode）后，对来自Coriell Institute的7个参考对照样品和25个药物不良反应组的临床样品在GridION设备上进行测序。使用Flip-Flop进行碱基识别、Porechop软件进行数据拆分、NanoFilt等生物信息学工具进行比对和变体识别的分析。 GridION的第一次运行产生了3百万条读长序列，最低覆盖度为200X——“用于基因分型绰绰有余”。研究最终鉴定到32个样品中的70个突变，其中21个与亚型上的已知等位基因匹配。对剩下的11个样品进行测序，他们发现了一个新的等位基因，或是已知等位基因的新亚型突变。Yusmiati及团队已经将这些结果提交到PharmVar数据库。 结合使用minimap2和nanopolish等工具（分别为定位和变体识别工具），团队获得了准确的变异检测。在大多数样品中，所有样品的单倍型都可以准确地检测到亚变性水平，其余样品或者具有新型变体，或者具有与当前PharmVar CYP2D6单倍型数据库不通的变体模式。通过分析样品单倍型之间的等位基因平衡还可以用来确定等位基因重复。 对于使用纳米孔测序数据能够将样品完全匹配到特定的突变，Yusmiati感叹 “很惊人”，而对于通过WhatsHap工具实现了突变分型，Yusmiati评论道：“非常干净，我们非常自信”。 在该研究中，Yusmiati还检测到了重复的等位基因。传统方法是通过双重PCR来靶向富集3.5kb的重复特异性区域以及此前的6.6kb区域检测，但该方法不能区分是哪个等位基因发生了重复，而这个区分对于确定表型是非常重要的。使用纳米孔测序，通过观察单倍型之间的等位基因比例，可以很容易的以2：1的比例来鉴定重复的等位基因。 Yusmiati还指出在创建或者打乱同聚物区域时，会丢失一些突变体，这可以在完成比对后的数据输出格式BAM文件中精确的检测到，但依赖于PCR的传统方法则无法检测到整个基因的删除或者缺失。 Yusmiati和她的团队计划使用这种方法来检测更多样本，以及探索富集自然DNA的CRISPR-Cas9来测序特别复杂的等位基因。 Yusmiati总结说，CYP2D6的纳米孔测序为基因分型、准确的单倍型分析以及新变体和重复等位基因的检测提供了高通量方法。 在另一篇今年2月发表在bioRXiv上的文章中，Yusmiati使用了MinION掌上测序仪来进行药物遗传学的多重测序。链接：http://dx.doi.org/10.1101/563262。 Oxford Nanopore Technologies产品目前仅供研究使用，不用于诊断程序。 |
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