London Calling 2019 最新纳米孔测序技术升级

完整视频，建议在WiFi环境下观看:

1. Nanopore产品和技术升级  Clive Brown 首席技术官

2. 软件 & 碱基识别  Stuart Reid 研发部资深主任

2. 软件 & 碱基识别  Stuart Reid 研发部资深主任

在未来几个月中将会有很多新功能被纳入纳米孔软件中，包括数据管理、识别修饰碱基、数据拆分以及用户需要对测序运行进行干预时的暂停功能。根据实验优先级的不同，提供不同的碱基识别选项，其中“快速”算法可用在时间结果至关重要的应用中。

原始（raw）和一致序列准确性（consensus）也是一个关键话题。新的“Flip-flop”算法已经为DNA和直接RNA的测序准确性带来了实质性的突破。Taiyaki算法允许用户训练自己的碱基识别器，进一步优化实验结果。Medaka通常用于从碱基识别中建立一致性序列（consensus），现在可用于识别纳米孔数据中的单核苷酸变体（SNVs）和插入缺失（indels）。

新的碱基识别方法可以用于过往的原始数据，信息都蕴含在信号中。Flip-flop碱基识别器已被纳入MinKNOW设备控制软件中，现在你不需要懂得命令行技能就可以得到最高的准确率。

MinKNOW是测序设备控制软件，是性能、数据管理、和可用性的关键。许多新的功能已经开始被整合到MinKNOW软件中，支持更好的用户体验。

就准确性，今天我将会讨论三点: 1. 原始 1D（单链） 准确率; 2. 一致性准确率（consensus accuracy）; 3. 变体识别（variant calling）。

第一点: 原始 1D（单链） 碱基识别 

• 我们每年都提供主要算法的提升：已经从开始的HMM，到RNN，到RNN传感器，到原始信号上的RNN，再到现在的Flip-flop。

• 在最新的碱基识别器中，每个碱基有两种状态：flip(正) 或Flop(反)。Flip-flop提升碱基识别性能，尤其是在均聚物方面（homopolymers）。

• 根据实验数据的需要，可以选择多种碱基识别模式选项: “快速”选项与传感器算法准确率相当；使用“高准确率”1D碱基识别器，DNA测序准确率约为~95%（原始准确率，modal），直接RNA测序准确率达94%（原始准确率，modal）。

• Taiyaki是新发布的训练工具，纳米孔社区的成员可以用它来训练自己应用的特定模型。Taiyaki可实时“同时”识别 5mC 和 6mA，从2019年7月起Guppy/MinKNOW软件也将支持这项功能。

可在Github下载：

https://github.com/nanoporetech/taiyaki

接下来呢？新研发中的Run Length Encoded 碱基识别器性能已经超越了Flip-flop。

第二点: 一致性准确率（consensus accuracy）

• Medaka是一个基于叠加序列的一致性序列修正工具，高度推荐使用以获得最佳的一致性准确性。

Medaka 现可以用于变体识别（variant calling）。使用纳米孔R9.4.1版芯片和最佳的工具，现在你可以进行SNPs识别，获得99%准确率。例如，使用当前的R9.4.1 版纳米孔, 利用Flip-flop碱基识别器和Medaka, 测序金黄色葡萄球菌（S.aureus）基因组，准确现达到Q44，其它的小型基因组准确率约 Q40。

可在Github下载：

https://github.com/nanoporetech/medaka

第三点: 结构变异识别（SV calling）

• 使用sniffles软件(可在GitHub下载): HG002基因组上达96% 召回率(recall)和精确率(precision)。

总结: 最近的碱基识别器可提供的1D（单链）准确率为：DNA 95% ；RNA 94%。使用正确的工具，在你现有的数据上，一致性准确率可高达Q44，SNPs达99%, SVs达96% (基于R9.4.1版芯片)。

3. 纳米孔和准确率  Lakmal Jayasinghe 纳米孔研究资深总监

目前的R9.4.1纳米孔是R9系列的一部分。它具有锐利的读取头，使其在混合序列区域表现非常好。要解决长度大于约5的均聚物的问题，其中一种方法是设计一种新型的纳米孔：R10就是我们的下一代纳米孔。使用更长的读取头，更多的基础支配信号。通过孔"看到”更长的均聚物（homopolymers），并且可以进行高准确度地解码。

R10现在可以提供与R9.4.1相当的原始读长准确度，在一致性准确性上已经远超过了R9.4.1，我们在运行条件和基本碱基识别算法方面进行了更多优化，以进一步提高通量，准确度和灵敏度。

去年5月，在内部测试中，使用R9.4.1 + R10芯片我们已经获得准确率Q41；2018年12月，仅使用R10芯片和Medaka，我们获得了Q42。到目前为止R10仅被一小部分纳米孔社区的科学家们进行过测试使用。在做大范围的发布前，我们还想进一步提升原始读长准确率、低样本起始量和通道数量。

最近几周，我们在单独使用R10时取得了进一步的进展，其中一部分是通过Medaka训练。在2019年5月，我们以30-50x的覆盖率达到>Q40，在金黄色葡萄球菌上以更高覆盖率已达到Q54。我们的目标是使R10的产量与R9.4.1一样大。我们现在可以在MinION R10芯片上获得26Gb测序数据，PromethION R10芯片上得到112Gb。

下一步是什么？

一个更好的R10。信噪比更好，更少堵孔，更好的产量，碱基识别器/模型，定制的一致性序列工具，针对直接RNA测序的改进……

我们有一条通往Q60数据的途径，包括新的化学成分，纳米孔的不同组合，新的碱基识别器和新的制备化学试剂。我们也会继续关注“R10b”、“R11”等等更新的纳米孔。

总的来说，R10即将到来，带着非常高的一致性准确度到来。

4. 测序试剂 Andy Heron 高级研究资深总监

样品制备的化学试剂也是纳米孔测序的基本组成部分，不断叠加的改进的强大在于他们为测序性能带来了显着提高。特别是从直接RNA测序（“基因组应用的新前沿”），到定性和定量cDNA测序，再到开发单分子一致性的多种方法。

Nanopore 样本制备相对简单，并且总有一种选择满足大部分的需求。

为了实现我们任何人在任何地点进行测序分析的目标，作为迈向经济且无压力的DNA提取和制备的第1步，我们开发了“野外测序试剂盒”，使用冷冻干燥来消除对冷链运输的要求，并将在秋季推出该试剂盒的混样建库测序。

使用最新的109版cDNA试剂盒，假设转录本长度为1Kb的情况下，你可以在一张MinION芯片上得到近2千万条读长，从PromethION 芯片上得到1亿条读长。 

只有纳米孔技术能够直接测序天然RNA，而使用纳米孔进行直接RNA的方式将会成为接近主流。这个夏季末即将推出升级版的SQK-RNA003试剂盒。

测序燃料消耗: 纳米孔测序的核心是马达蛋白，它们通过消耗ATP来精准且有节律地逐步使DNA分子通过纳米孔。当加入高浓度的测序接头时，燃料消耗得就更快。尽管我们现在有ATP燃料补充法，我们希望为用户提供无人值守得测序。我们正在通过重新设计测序接头来开发新的再生化学试剂，我们希望您能够在无需查看的情况下运行PromethION 6天。

自动文库制备仪VolTRAX 2 比首版具备更好的用户体验。VolTRAX 2有加热元件，可加热到98C，让你可以在设备上进行PCR；磁性元件控制提取和纯化，以及光学元件让你可以测量DNA以便定量或进行质控。

仅靠算法我们的原始读长准确度提升到了约95%，我们并不认为这会是终点，它还会继续提升。对于一些应用来说，单个分子测序准确度达到Q30十分有用。我们目前正在研发获得Q30单分子准确率的方法，包括独特分子标识(UMIs)；能够产生>100Kb读长、包含原始分子的重复组成的线性和环状一致性方法；使用20x的滚动环状扩增。

5. 发布时间  Rosemary Dokos 资深产品管理总监  

随着通量和产量的持续提升，我们希望可以为大家提供更好的每Gb价格，现在Flongle推出了，加上PromethION的全面推出，大家有了完全的灵活度去做想做的事情，重要的是不论是每样本的价格还是每Gb的价格完全在大家掌控之中，欢迎大家持续给与我们反馈怎样给大家提供更好的产品和服务。

2019年9月20-26日，Oxford Nanopore Technologies将在香港、北京和上海三地举办纳米孔测序的技术之旅Nanopore Tech Tour ，包括全体会议、分组会议、闪电演讲、科研海报，您还可以参与测序运行从上样到结果分析的实践，与前沿纳米孔科学家交流，和纳米孔技术专家面对面讨论。