【应用案例】肠道微生物群的病原菌鉴定和种属鉴定

我们身体和环境的微生物的组成会对我们的健康产生深层影响。例如，人类微生物组的组成与肥胖、免疫和精神疾病有关。

现代测序技术的出现为微生物分析领域带来了极大优势，但传统测序方法依然面临一些挑战，如很难可靠地解析重复区域，加之其他如得出检测结果所需的时间和成本效益等考量，16S rRNA基因测序应运而生。然而，通常用于这类实验的16S引物并不覆盖整个16S基因区域，这可能降低物种鉴定的分辨率。

纳米孔长读长更适合组装重复的基因组区域，提高宏基因组物种鉴定的精度。此外，在基于16S的研究中，纳米孔技术允许引物的设计覆盖整个16S基因甚至整个核糖体操纵子，能准确分辨更多物种，且使用Oxford Nanopore的VolTRAX™自动文库制备系统，可进一步精简项目工作流程。

Oxford Nanopore为微生物组研究中使用的宏基因组和基于16S的测序方法提供易于遵循的工作流程。Oxford Nanopore推出了一款带有条码标签的16S文库制备试剂盒，用于从多个样本进行具有成本效益的物种鉴定（图1）。

图1使用带实时分析的16S测序快速鉴定微生物

同时Oxford Nanopore提供一系列的DNA文库制备试剂盒，包含低起始量和条码标签选项，以满足所有实验需求。文库制备最少仅需10分钟。数据分析使用WIMP生物信息学工作流程实现，可以在测序进行的同时实时鉴定宏基因组样本中的细菌、真菌、古细菌和病毒（图2）。

图2 WIMP报告示例

实际案例1

与婴儿相关的肠道微生物群（BAMBI）——临床案例

坏死性小肠结肠炎（Necrotising enterocolitis （NEC）） 是对早产和体重不足的婴儿影响最严重的肠胃疾病之一 ，微生物菌群失调（失衡）已被认定为该疾病最可能的潜在原因。先前的研究显示，患有NEC的早产儿有更多的潜在致病菌，而有益的两歧双歧杆菌（Bifdobacterium bifdum）则较少。

英国诺里奇厄勒姆研究所（Earlham Institute）的Matthew Clark博士和Richard Leggett博士的团队使用宏基因组纳米孔测序来分析早产儿的肠胃微生物群，不仅鉴定其中的物种，还将其量化并分析其抗微生物药物耐药性（AMR）。他们的研究是与英国诺里奇卡德拉姆生物科学研究所（Quadram Institute of Biosciences） Lindsay Hall博士一起进行的益生菌治疗临床试验的一部分。

通过一个时程实验（time-course experiment），该团队得以观察益生菌和抗生素治疗对微生物组成的影响。施用益生菌后，婴儿肠道中的两歧双歧杆菌（B.bifdum ，鉴定至种属层级）增加，长读长纳米孔测序和短读长平台都得出类似的分析。

有趣的是，研究人员还注意到纳米孔宏基因组测序方法与使用短读长测序平台的16S rRNA分析相比，能得出更细化的分类，而后者无法区分肠杆菌属（Enterobacteriaceae）中的物种。该团队利用对一位重症婴儿粪便样本进行的实时分析，成功在测序一小时内识别出了病原体肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的存在，并进行了相应的AMR分析。

* Oxford Nanopore Technologies产品仅限研究使用，不用于诊断程序。

实际案例2

长读长在16S微生物组研究中的优势

基于16S的种属鉴定是微生物组研究中最常用的方法。Shin 等使用16S法，并应用短读长测序技术和长读长纳米孔测序技术来研究鼠肠道微生物群的组成。这两种方法之间的一个关键区别在于，短读长实验中，V3-V4 16S高变区被用来进行引物设计和扩增子生成（平均读长—447bp），而纳米孔测序使用了全长16S基因（平均读长—1393bp）。

两个平台得出的测序数据在除种属层级外的所有分类层级都表现出了高度一致性（R2=0.8-0.9）。研究显示，纳米孔数据能鉴定出更多种属（即动物双歧杆菌和假长双岐杆菌 ，肠道微生物组27种众所周知的成员），从而实现更加完整的微生物群代表架构。

该研究表明，种属鉴定时常用的V3-V4 16S区的方法，其敏感度不如通过纳米孔测序实现的全长16S基因的方法敏感度高。由此得出结论，相比于短读长技术，纳米孔测序的长读长优势有助于更精确地分析鼠肠道微生物组。

图3 16S rRNA基因序列中的变异性。16S rRNA基因序列间检测到的变异在16S rDNA序列上表现为竖线。黑色及红色箭头分别代表V3-V4区扩增引物组的结合位置以及16S rDNA序列（纳米孔测序）的近全长区。图像改编自Shin等。