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Clive G Brown | 技术和产品更新【2018 Nanopore 科研大会】Oxford Nanopore首席技术官, Clive G Brown，在科研团体大会分享Nanopore最新的动态! Clive G Brown, Oxford Nanopore首席技术官, 在近日举办的2018科研团体大会上分享了最近的研究进展和技术展望。 在了解技术和产品更新前，让我们首先回顾一下什么是纳米孔传感测序技术。 图1. Nanopore测序工作原理 纳米孔技术是一种独特的实时、长读长、完全可扩展的技术，允许直接测序原始DNA和RNA。 在纳米孔测序中，读长长度=输入片段长度。读长长度不取决于测序设备，用户可以通过所使用的文库制备实验方案来控制片段长度。例如，目前DNA片段长度最高记录为>2 Mb。 测序时，DNA快速通过纳米孔。DNA片段通过纳米孔的速率已从推出时的每秒35个碱基提升到了现在每秒450个碱基。每一个在阵列上完成的读长，在数秒后就可以用来开始数据分析，而不是几小时甚至几天。
Clive 给予了多种增强准确度的策略概述，例如训练集、碱基识别算法、组装、polish和化学试剂。 R10 纳米孔 R10 是一个新纳米孔设计，预期在2019年早些时候发布。R10版纳米孔的“桶身”更长，具有两对Reader heads。 这意味着更多的碱基主宰信号以达到更高的准确度，尤其是在均聚物（由一种单体聚合成的）方面。碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，质量值（Q）越高代表碱基被测错的概率越小。在内部测试中，以75x覆盖度，新的R10纳米孔能够提供质量值>Q40以及一致性（identity）质量值Q50 。 研发团队已开始着手于R10的工作，并发现了其中需要提升的部分。计划在接下来的数周内发布。 图2. 新R10纳米孔 Flip-flop 碱基识别软件 我们已经发布了一个新的可以增强准确性的碱基识别软件。这个新的碱基识别软件含有名为“flip-flop”算法。单个碱基具有单个概率分配。 图3. 基于“flip-flop”算法的新碱基识别软件 这个新的“flip-flop”碱基识别软件为R9的共有序列一致性提供了大的提升——重新识别现有数据可取得Q37。这个软件将在12月中旬通过Guppy软件发布。Guppy是Oxford Nanopore提供的一款生成碱基识别软件，经过优化，可与碱基识别加速器一起运行。我们目前正在进行R10版本的工作，预计质量值提升至Q42。 你可以通过http://bit.ly/2Q0EApc访问新碱基识别软件。 甲基化分析也被整合到了其中，现在已经允许使用R9.4进行5mC (CpG)的识别。 线性测序Linear Consensus Sequencing (LCS) 着眼于单碱基准确度，而不是共有序列准确度，Clive勾勒了一个新的名为线性测序（LCS）的方法。这种方法将一条链的数条拷贝结合在一起，通过一条读长进行测序，以获得更高的准确度。LCS保存原始模板链，以及碱基修饰信息。 图4. 线性测序Linear Consensus Sequencing (LCS) 文库制备方法 8B4是一个提升准确性的新文库制备方法来获取更丰富的信号。我们目前正在精调8B4的碱基识别和共有序列方法。 1D^2 试剂盒 1D^2 测序运行对两条链均进行了测序（图5），在保留碱基修饰的同时，提供高单碱基准确率。1D^2 试剂盒的更新将单条读长准确度提高到了98%。新的1D^2 化学试剂含有带独特识别器（unique pairing identifiers, UPIs）的连接接头，支持用于扩增子。PCR测序允许1D^2使用任何PCR试剂盒。 图5. Nanopore 1D 和1D^2测序 RNA 测序 纳米孔测序是唯一能够直接测序天然RNA链的技术。表达量数据质量控制联盟(ERCC) 是一种最常用的RNA spike-in（一种测量校准方式）。ERCC spike-in panel assay 显示RNA测序文库能够被定量，从而允许可信的基因组注释和异构体重构。 图6. 使用Nanopore RNA测序的准确的异构体重构 RNA/cDNA试剂盒在接下来的数周时间将会更新。RNA分析现在已可以在PromethION进行。值得一提的是，现在MinION已经能够生成1750万条读长。 图7. Nanopore 直接RNA/cDNA测序 结构变异 Clive 讲述了一个能够帮助结构变异分析的更新，旧数据也能够重新被分析。就算是在低覆盖度，使用HG002样品的结果证明，重新识别和精确度值都很好。HG002是GIAB投放的第二批标准基因组，提取自一个德系犹太种族的男性。 靶向区域选择 Clive回顾了一个靶向选择过程，来对人类基因组中重复的、传统技术难以解析的区域进行富集。该方法简单，耗时约90分钟。它能够切割2-20kb的片段，敏感且特异 （5ug，每个基因200-2000x覆盖度）。使用Flongle测序分析10个基因panel，生成了具有临床意义的结果。 图8. 靶向区域选择 产品更新 Clive在回顾了当前nanopore设备的产量后表示，与其它平台相比，现阶段的性能已使得每个碱基的价格极具竞争力。 我们在近期发布了用于MinION和GridION的测序芯片更新-——Rev D版本。新发布延长了测序芯片能被用于DNA或RNA测序的时间，将总DNA数据产量提升至高达30Gb每张芯片。目前在我们内部已能够得到50Gb。 图9. 便携式MinION测序仪 PromethION x24 和 PromethION x48设备 在2019年将有两个新版的PromethION设备: X24 和 X48。 图10. 新版PromethION x24 和 PromethION x48 当前最佳的PromethION用户运行已经非常接近150Gb 每张芯片，产量中位数为~60Gb。目前的内部记录为220Gb每张芯片，运行全部24张芯片为3.8 Tb。意味着一台可启用48张芯片的设备应能够交付7Tb数据。 我们的价格体系是为任何一位科学家都能使用纳米孔测序而设计。PromethION在无需资本投入的情况下即可以得到（购买耗材），我们现在还提供额外的CapEx选择(购买仪器)。 MinION Mk1c MinION Mk1c 是一个集MinION测序仪、便携式分析仪MinIT 和一个屏幕为一体的设备，可通过WiFi/蓝牙和SIM卡连网。MinION Mk1c 正在进一步的研发中，预期在2019年中期发布。 Flongle Flongle 是MinION测序仪的适配器，允许用户运行更小型的、快速的测试。Flongle是临床市场的关键所在，能够以经济的价格得到快速并丰富的数据。Flongle已在10月送达部分用户手中，在实际使用中，当前用户记录为：测序运行22小时获得单张芯片1.8Gb数据。 VolTRAX 最后， Clive 回顾了自动文库制备仪VolTRAX。它也正在被研发成一种基于液滴的独立测序仪，将非常适合单细胞测序和其他新型应用。
在接下来的几天，我们将会陆续发布更多的会议科研资讯，并会发布此次Clive技术产品更新的演讲视频，稍后还将为大家总结和回顾nanopore平台的产品和性能。敬请加星公共号，持续关注！ 延伸阅读 动态资讯Day 1 | 2018 Nanopore科研团体大会 Nanopore测序初级实验和数据分析培训班【北京11.29-11.30】 |